Saiba o que é PCR e como utilizá-lo na rotina clínica com gatos e cães

A técnica de PCR – reação em cadeia da polimerase – um marco na biologia molecular, possibilita a realização de diagnósticos de doenças a partir de uma quantidade pequena de DNA. Saiba mais sobre esta técnica que revolucionou a medicina diagnóstica. 

A técnica de PCR – Polymerase Chain Reaction ou Reação em Cadeia da Polimerase – foi desenvolvida em 1983 pelo bioquímico Kary Banks Mullis, revolucionando a biologia molecular, pois possibilita produzir até cem bilhões de moléculas similares em uma reação a partir de uma pequena sequência de ácidos nucleicos (DNA).  

A técnica impactou os estudos moleculares e possibilitou aumentar a sensibilidade dos testes, uma vez que possibilita a detecção de patógenos com grande precisão. 

O que é o PCR? 

A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica laboratorial para produzir (amplificar) de milhões a bilhões de cópias de um segmento específico de DNA, para que possa, então, ser estudado em maior detalhe.  

O processo do PCR é baseado em três etapas que são necessárias durante o processo de reação de síntese de DNA (Imagem 1): 

• Inicialmente há a desnaturação do DNA alvo em fitas simples 
• Adição da amostra da sequência de DNA iniciadoras (conhecidas como primers) em cada fita original para síntese de novas fitas 
• Replicação e extensão das novas cadeias de DNA dos iniciadores 

Os diferentes componentes utilizados para realizar o PCR são:  

• Molde de DNA: a região do fragmento de DNA a ser amplificado; 
• Primers: determinam o início e o fim da região a ser amplificada pela DNA polimerase; 
• DNA polimerase – principal enzima da replicação:  monta uma nova fita de DNA a partir do molde;  
• PCR Buffer: fornece um ambiente químico adequado para a polimerase realizar a amplificação; 
• Desoxiiribosenucleotídeos – (dNTPs): monômeros que a DNA polimerase usa para formar DNA; 
• Cloreto de magnésio: cofator para aumentar o rendimento da reação. 

Uso do PCR na medicina veterinária  

A técnica do PCR tem sido utilizada em diversas áreas de pesquisa na medicina veterinária, em testes com alta sensibilidade e especificidade, possuindo vasta aplicação – principalmente para o diagnóstico de doenças que acometem animais.  

A técnica pode ser aplicada em inúmeras áreas como, por exemplo, sequenciamento genômico de animais e agentes infecciosos, genética, medicina forense e como técnica diagnostica para diversos agentes infecciosos e cepas de genes específicos (Hass & Torres, 2016). 

Quando usar o PCR na medicina veterinária? 

O PCR oferece aos médicos-veterinários uma técnica de ensaio viável para alcançar um diagnóstico definitivo de uma forma minimamente invasiva, desde que a amostra correta seja fornecida. 

Confira, a seguir, algumas das doenças em que podemos utilizar o PCR como método diagnostico na clínica de pequenos animais. 

Leptospirose 

A leptospirose é uma doença zoonótica causada pela infecção por qualquer um dos vários sorovares patogênicos de Leptospira. 

A doença afeta praticamente todos os mamíferos e tem uma ampla gama de efeitos clínicos, desde infecção subclínica leve até a falência de múltiplos órgãos e o óbito.  

A leptospira é mantida na natureza através da urina eliminada pelos animais portadores (como os ratos e até cães, considerados a maior fonte da infecção humana), e estes animais podem liberar leptospiras na urina durante anos.  

Babesiose 

A babesiose é uma hemoparasitose causada pelos protozoários do gênero Babesia, transmitidos por carrapatos. A doença acomete mamíferos domésticos, selvagens e seres humanos – sendo considerado uma zoonose.  

Com potencial para ser fatal, a babesiose é tipicamente caracterizada por febre e hemólise intravascular, levando a anemia progressiva, hemoglobinúria e icterícia.  

Leishmaniose 

A Leishmaniose é causada pelo protozoário da espécie Leishmania chagasi, e a doença é transmitida através da picada da fêmea infectada do flebotomíneo Lutzomia longipalpis – o mosquito palha. 

O cão é considerado o principal reservatório da Leishmania, enquanto contaminado pela leishmaniose visceral canina. As manifestações clínicas da leishmaniose em cães são:  

• caquexia progressiva;  
• hipergamaglobulinemia;  
• hepatoesplenomegalia;  
• anemia;  
• infadenopatia; 
• lesões ulceradas principalmente ao redor dos olhos e focinho. 

Parvovirose 

A parvovirose é causada por um vírus da família Parvoviridae, que promove intensa destruição do epitélio intestinal e acomete tanto canídeos selvagensquanto cães e gatos. Os parvovírus são vírus extremamente resistentes e que podem sobreviver durante meses em condições frescas e úmidas, protegidos da luz solar. Eles também permanecem vivos quando congelados. 

Os sinais clínicos da doença em animais incluem letargia, depressão e inapetência cerca de quatro ou cinco dias após a exposição, seguida de febre, vômito e diarreia. As fezes apresentam-se diarreicas, com odor forte e pode conter muco ou sangue. 

Giardíase 

A giardíase é uma infecção parasitária, causada pelo parasita protozoário flagelado Giardia spp., que pode ser encontrado em solo, alimentos e água contaminados com fezes. 

Alguns cães giardíase podem não apresentar quaisquer sinais de infecção, mas cães mais jovens ou com sistema imunológico enfraquecido têm maior probabilidade de apresentar problemas. Em geral, os sinais clínicos da giardíase são diarreia com esteatorreia, desconforto abdominal.  

Devido a presença do parasita no solo, é comum cães se reinfectarem com Giardia e, por isso, o tratamento bem-sucedido, além de medicamentos antiparasitários eficazes, também depende da limpeza e gestão do ambiente circundante – tanto no interior como no exterior. 

Cinomose 

O vírus da cinomose canina faz parte da família Paramyxoviridae e tem distribuição por todo mundo. É uma doença infeciosa altamente contagiosa e de alta mortalidade, acometendo animais domésticos e selvagens.   

Seus sinais clínicos são inespecíficos e a condição pode ser subaguda e aguda, variando em gravidade e podendo se tornar fatal rapidamente. Dentre os seus principais sinais clínicos estão quadros respiratórios, gastrointestinais e neurológicos.  

Embora seja encontrado em todo o mundo, o vírus possui maior probabilidade de disseminação em populações com taxas de vacinação reduzida e grandes populações de cães. 

Principais cuidados na coleta do exame de PCR em cães e gatos 

O médico-veterinário deve ter cuidado na coleta, armazenamento e transporte de amostras quando solicitar exames laboratoriais. Isso porque falhas no manuseio da amostra antes de chegar no laboratório podem comprometer o resultado. 

Alguns cuidados que o médico-veterinário deve ter no momento da amostragem são: 

• quantidade e número de amostra representativa: deve se considerar o agente suspeito, a etiologia da doença e objetivo do exame (diagnostico ou acompanhamento); 

• cuidado com a amostra: quantidade, ausência de contaminantes, utilização de recipientes apropriados e selados para evita contaminação cruzada; 
• transporte em condições apropriadas: amostra refrigerada resfriada (2-8°C) ou congelada, pois a temperatura baixa previne o crescimento de microrganismo, autólise ou putrefação que compromete o resultado do PCR. 

Qual material deve ser coletado? 

O material utilizado para a análise varia de acordo com a doença pesquisada. Para as doenças descritas anteriormente, temos os seguintes materiais. 

• Leptospirose: sangue total e urina (testados simultaneamente, pois possibilitam o diagnóstico nas fases iniciais da infecção, além da detecção de eliminação urinária em animais doentes);  
• Babesiose: sangue total em EDTA; 
• Leishmaniose (qualquer amostra biológica): sangue, líquidos corporais, aspirados do baço, medula óssea e linfonodos; 
• Parvovirose: fezes ou swab retal; 
• Giardíase: fezes ou aspirados duodenais obtidos por endoscopia; 
• Cinomose (qualquer amostra): sangue (enviar em EDTA), urina, fezes, líquor, secreção conjuntival e saliva. 

O PCR pode dar falso-negativo ou falso-positivo? 

Em relação ao resultado obtido durante o exame de PCR, o laboratório deve possuir uma série de controle para a realização do teste, desde a extração de ácidos nucleicos até o processo final de amplificação.  

A alta sensibilidade da PCR pode levar a falsos positivos se as amostras ou reagentes estiverem contaminados com ácidos nucleicos do agente infeccioso (controles positivos) ou produtos de ensaios de PCR recentes 

O falso-negativo pode ocorrer: 

• em caso de, na busca de patógenos fúngico ou bacteriano, haver a administração de medicamentos antibacteriano ou antifúngico – pois não haverá material genético para detecção; 
• em caso de amostra armazenada de forma inadequada, pois ocorre degradação do DNA e inviabilização da detecção. 

Outras recomendações da Royal Canin® 

Por se tratar de doenças infeciosas, o médico-veterinário pode orientar o tutor quanto ao manejo a fim de minimizar que animais contraiam estas doenças, como: 

• protocolo de imunização completo quando filhotes e reforços anuais; 
• fornecimento de dieta balanceada com manejo nutricional de acordo com as necessidades do animal de acordo com tamanho, idade e raça; 
• higienização e cuidados com limpeza do ambiente;  
• consultas regulares com médico-veterinário para acompanhamento da saúde do animal. 

A ROYAL CANIN® possui no seu portifólio uma linha completa e balanceada de alimentos para filhotes, animais adultos e maduros, desenvolvidos para atender as diferentes etapas de vida dos animais.  

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Referências Bibliográficas

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Cornell Richard P. Riney Canine Health Center. Giardia: Infection, treatment and prevention. Acesso em: 28/11/2023 

Haas D. J.; Torres, A.C. D. Aplicações das técnicas de PCR no diagnóstico de doenças infecciosas dos animais. Revista Científica De Medicina Veterinária – issn:1679-7353, ano xiv, n 26, 2016 . 

IDEXX, Diagnosing and Managing Canine Leptospirosis. Idexx Diagnostic Update, 2014. Acesso em: 28/11/2023 

Lunn, K. F. Leptospirosis in Animals – Overview. Acesso em: 01/12/2023 

Mazzinghy, C., Da Fonseca Junior, J., D., Mazinghy, C. L., Franca, E., C., Pinow, A. C. S., Almeida, K. S. Leishmaniose visceral canina: Revisão. Pubvet, v. 15, n. 03, 2021. Acesso em 02/12/2023 

Moraes, M. ., & Freire, C. G. V. Cinomose canina: aspectos relacionados ao diagnóstico, tratamento e vacinação. Pubvet, n. 13, v. 02, 2019. Acesso em 29/11/2023 

National Human Genome Research Institute, POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR). 2023. Acesso em: 01/12/2023.  

Navarro, C., Cáceres, A., Gaggero A. Detection of Canine Parvovirus in Dogs by Means Polymerase Chain Reaction. Am J Biomed Sci & Res. n. 7, v. 6. 2020. Acesso em: 29/11/2023 

Pestana et al., Early, Rapid and Sensitive Veterinary Molecular Diagnostics – Real Time PCR Applications, 2010.  

Vieira, V. P. C., Figueiredo, N. M. Leishmaniose Visceral Canina: Breve revisão e relatos de casos. Revista Veterinária e Zootecnia, v. 28, 2021. Acesso em: 28/11/2023